Nature Communications：迄今为止最小的Cas9基因剪刀

　　韩国基础科学研究所(Institute for Basic Science, IBS)，韩国首尔大学等处的研究人员设计出了目前最小的CRISPR-Cas9，并通过腺伴随病毒(AAV)将其递送到了肌细胞和小鼠的眼睛里，用以编辑导致失明的基因。

　　这一研究成果发表在Nature Communications上，这种CRISPR-Cas9系统源自空肠弯曲杆菌(CjCas9)，未来也许会成为一种有效治疗一般疾病和“无药可救”的疾病的新工具。

　　CRISPR-Cas9红得发紫，作为“基因剪刀”蛋白，Cas9需要在导向RNA指引下在精确靶基因位置进行切割。CRISPR-Cas9复合物要想到达靶标DNA，就需要通过质粒或病毒递送。IBS基因组工程中心主任KIM Jin Soo解释说：“AAV是一种在体内表达目标基因的有效和安全的载体，已广泛用于基因治疗。”

　　天然状态下，Cas9是细菌的免疫武器，切割可能损害细菌的病毒DNA。最常见的CRISPR-Cas9技术使用的是源自细菌化脓性链球菌的Cas9。然而这个蛋白由1,368个氨基酸组成，体积太大不能通过AAV包装和递送。即使科学家们将其分成两部分，分别包装在不同的病毒，也会出现其它的问题，如需要两倍的病毒量，活性要比完整的Cas9小。金黄色葡萄球菌Cas9也可以用于基因编辑，且体积稍小(1,053个氨基酸)，因此它可以通过AAV传输，但这种Cas9又没有足够的空间可以装载其它蛋白。

　　在这项最新研究中，研究人员发现CjCas9大小合适，而且高效，这个蛋白有984个氨基酸，可以与多个导向RNAs，还有荧光报告基因一同包装进AAV中。

　　为了利用细菌蛋白进行基因编辑，研究人员优化了这一技术，他们设计了一个短的DNA序列，接在紧挨着Cas9靶向的DNA序列，即Protospacer Adjacent Motif(PAM)。每个不同的Cas9需要一个特定的PAM序列，否则就无法结合，并切割靶标DNA序列。此外，研究人员还修改了导向RNA的长度。

　　完成这种优化后，研究人员将新的CRISPR-Cas9复合体，连同两个导向RNA和荧光报告蛋白一起包装到AAV中，朝着小鼠肌肉和眼睛中的突变基因传递。他们主要聚焦于涉及年龄相关性黄斑变性(AMD)的两个基因，这也是成年人失明的主要原因之一。

　　一个基因是ADM的常见治疗靶标，称为血管内皮生长因子A(VEGF A)，另一个基因是激活VEGF A的转录的转录因子：HIF-1a。后者此前并未被当作药物靶标。在这项研究中，研究小组证明CjCas9通过AAV传递到了视网膜，可以有效地使小鼠中的Hif-1a和VEGF A失活，并减少脉络膜新血管形成(CNV)的面积。

　　KIM Jin-Soo解释说：“CjCas9具有高度特异性，不会出现基因组中的脱靶突变。”